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分子生物研究的革命性技術-PCR技術
雙擊自動滾屏 發布者:dindin 發布時間: 閱讀:5049

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR,是一種分子生物學技術,用于放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復制。

DNA聚合酶(DNA polymerase I)最早于1955年發現 ,而較具有實驗價值及實用性的Klenow fragment of E. Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發現,但由于此酶不耐高溫,高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應。現今所使用的酶(簡稱 Taq polymerase), 則是于1976年從 溫泉中的細菌(Thermus aquaticus)分離出來的。它的特性就在于能耐高溫,是一個很理想的酶,但它被廣泛運用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復復制,它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發表了第一個單純且短暫性基因復制(類似PCR前兩個周期反應)的實驗。而現今所發展出來的PCR則于1983 Dr. Kary B. Mullis發展出的,Dr. Mullis當年服務于PE公司,因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年與 Saiki 等人正式表了第一篇相關的論文。此后,PCR的運用一日千里,相關的論文發表質量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨后PCR技術在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用,成為分子生物學研究的一項革命性技術。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學獎。

PCR原理】

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶與啟動子的參與下,根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,并設計引物做啟動子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的應用和發展。

發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,并逐步應用于臨床。

PCR步驟】

標準的PCR過程分為三步:
1.DNA
變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下, 氫鍵斷裂,形成單鏈DNA
2.
退火(25℃-65℃):系統溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。

3.
延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′→3′端延伸,合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。

現在有些PCR因為擴增區很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應速度。

PCR檢測】

PCR反應擴增出了高的拷貝數,下一步檢測就成了關鍵。熒光素(溴化乙錠,EB)染色凝膠電泳是最最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的,因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行,成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法,有逐漸取代電泳法的趨勢。

PCR反應特點】

特異性強

PCR反應的特異性決定因素為:
引物與模板DNA特異正確的結合;
堿基配對原則;
③Taq DNA
聚合酶合成反應的忠實性;
靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高。

靈敏度高

PCR產物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克(pg=10- 12)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3RFU(空斑形成單位);在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

簡便、快速

PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在24 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。

對標本的純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

 
 

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